Първо действие – Църквата Сант’Андреа Дела Вале в Рим.
Завесата се вдига под оркестровия грохот на три съкрушителни акорда, музикален мотив, свързан с шефа на полицията, барон Скарпия. Следва втори мотив – неспокойна, низходяща синкопирана тема, която се свързва с преследването на беглеца Чезаре Анджелоти. Той се появява в църквата, изтощен и тръпнещ от страх. Симпатизант на републиканците, той е хвърлен в затвора от роялистите. Бягството му е уредено от сестра му маркиза Атаванти, която му е оставила ключ от семейния параклис и е скрила там женско облекло за дегизиране. Анджелоти намира ключа и се скрива в параклиса.
Клисарят пристига в църквата. Той се оплаква от задължението си да мие четките на художника Марио Каварадоси. Каварадоси рисува портрет на Мария Магдалена. Той е уловил образа на маркизата, когато е идвала в църквата привидно да се моли. Каварадоси сравнява нарисуваната от него руса и синеока Магдалена (маркизата) и любимата му Флория Тоска, с по-средиземноморска, тъмна красота. Той споделя, че Тоска единствена притежава сърцето му. Клисарят си тръгва, като оставя на Каварадоси кошница с храна и вино за вечеря.
Анджелоти излиза от скривалището. Каварадоси разпознава своя стар приятел. Двамата си спомнят за своите общи политически симпатии. Те са прекъснати от гласа на Тоска отвън: „Марио!” Каварадоси дава на Анджелоти кошницата, и го отпраща в параклиса.
Тоска е дълбоко религиозна, но също така и обсебващо ревнива. Тя влиза раздразнена, изпълнена с подозрения, защото смята, че е чула Каварадоси да говори с някаква жена. Ревността й се разпалва от картината. Каварадоси я покорява със своя плам. Влюбените планират среща във вилата на Каварадоси, след вечерната изява на Тоска.
След като Тоска си тръгва, Анджелоти излиза от скривалището. Той разкрива, че планира да избяга от Рим. Каварадоси му дава ключ от вилата си извън града и го съветва, ако има опасност, да се скрие в кладенеца в градината. Изстрел на оръдие от крепостта обявява, че е избягал затворник. Каварадоси и Анджелоти бързо напускат църквата.
Клисарят се завръща. Той и момчетата от хора се радват, че вечерта в Палацо Фарнезе ще има празник в чест на кралицата и изпълнение на оперната певица Флория Тоска. Веселието е прекъснато от неочакваното пристигане на барон Скарпия и неговите агенти от полицията. Настъпва тишина, всички остават като вцепенени. Скарпия съобщава на клисаря, че важен затворник току-що е избягал и че според него той е потърсил убежище в църквата.
Скарпия намира ветрило с герба на маркиза Атаванти. Агенти изнасят от параклиса кошница за провизии. Скарпия сглобява всички находки: Анджелоти се е укрил в параклиса, а любовникът на Тоска, художникът Каварадоси, не само е подпомогнал беглеца, но със сигурност знае местонахождението му.
Тоска се връща в църквата, търсейки Каварадоси – но намира Скарпия и неговите агенти. Скарпия вежливо ласкае Тоска. Той намеква, че маркизата е любовница на Каварадоси и че те са избягали заедно във вилата му. Вбесена и изпълнена с ревност, Тоска се втурва към вилата на художника, за да разобличи влюбените, без да подозира, че Скарпия праща агенти да я последват.
Свещената музика на Te Deum се издига и набира мощ; хората започват да изпълват църквата. Скарпия злорадства за предстоящия си успех: той ще открие и екзекутира Анджелоти; ще унищожи и Каварадоси, а крайната му победа ще е завладяването на Тоска. Скарпия коленичи в молитва, разкривайки истинската страст в душата си: Tosca, mi fai, dimenticare Iddio (Тоска, ти ме караш да забравям Бога).
Второ действие – апартаментът на Скарпия в Палацо Фарнезе.
Скарпия вечеря сам, а в двора долу кралица Каролина е домакин на тържество. Нова кантата ще бъде изпята от Флория Тоска. Скарпия нарежда на Шароне да изчака Тоска на входа на двореца и да й предаде, че баронът ще я очаква след кантатата.
Сполета докладва, че не са открили Анджелоти във вилата. Там са задържали Каварадоси и са го довели в Палацо Фарнезе. Докато Скарпия разпитва художника в стаята, от двора долу се чува как Тоска пее кантатата. Скарпия обвинява Каварадоси, че се е срещнал с избягалия затворник Анджелоти, снабдил го е с храна и дрехи и го е завел във вилата си. Художникът гневно отрича.
Тоска пристига и остава стъписана, когато вижда Каварадоси там. Втурва се да го прегърне и той й прошепва, че не трябва да казва нищо за онова, което е видяла във вилата. Скарпия обявява, че съдията е в съседната стая в очакване на показанията на Каварадоси. Баронът се опитва да манипулира Тоска, но тя отрича да знае местонахождението на Анджелоти. Чуват се стоновете на измъчвания Каварадоси. Скарпия отново съветва Тоска да спаси любимия си, като разкрие истината. Каварадоси я призовава да бъде смела и да мълчи. Скарпия нарежда изтезанието да се засили. Тоска не може повече да понесе болката на любимия си. За да го спаси, тя издава скривалището на Анджелоти. Каварадоси е доведен, ранен и кървящ. Тоска утешава любимия си с целувки и сълзи. Скарпия възкликва предизвикателно „В кладенеца, в градината!” Той изпраща Сполета там. Каварадоси проклина предателството на Тоска.
Шароне се втурва с новината, че Наполеон е победил австрийците при Маренго. Каварадоси, слаб и измъчен от изтезанията, е обзет от патриотичен изблик при вестта за победата: Vittoria! Vittoria! Той проклина Скарпия и всички тирани, с което разкрива революционните си републикански симпатии. Скарпия веднага го праща в затвора за екзекуция. Останал сам с Тоска, баронът намеква, че може би двамата могат да го спасят. Тоска рязко прекъсва играта му и високомерно му предлага да преговаря: Quanto? Il prezzo? (Колко? Кажете цената!). Скарпия признава, че отдавна се възхищава на красотата й, а гневът и омразата й към него само са засилили решимостта му. Тоска осъзнава, че е безсилна. Скарпия не обръща внимание на молбите й за милост. Но опитите му да я завладее чрез убеждаване не успяват и той се нахвърля върху нея физически.
Зловещи удари на барабан се чуват в далечината – сигнал, че се издига бесилка за изпълнение на смъртна присъда. Скарпия предупреждава Тоска, че няма време. Нейният любим има само един час да живее, и сега в нейна власт е да реши съдбата му.
Духът на Тоска е сломен. В арията Vissi d’Arte (Живях за изкуството), Тоска се пита „Защо Бог ме е изоставил?” и излива отчаянието си в трогателна молитва.
Идва Сполета и съобщава, че Анджелоти е бил заловен, но е взел отрова и е умрял. Когато пита за Каварадоси, Скарпия се обръща към Тоска, тя сега има власт над съдбата на любимия си.
Скарпия е коварен, но Тоска е решена да спаси своя любим. Тя кима в съгласие. Скарпия уговаря фалшива екзекуция. Сполета показва пълно разбиране на зловещите и двулични намерения на Скарпия. Баронът нарежда на Сполета да допусне Тоска в затвора в четири часа, за да съобщи на Каварадоси плана. Тоска иска той да предостави на влюбените пропуск за напускане на Рим. Скарпия се съгласява.
Докато той пише пропуска, Тоска забелязва нож на масата. Тя грабва ножа и го скрива зад гърба си. Скарпия тръгва към Тоска, възкликвайки победоносно: Tosca finalmente mia! (Тоска, най-сетне моя!). Когато се опитва да я прегърне, Тоска забива ножа в сърцето му: „Ето целувката на Тоска, за която толкова страстно копнееше”. Тоска се оглежда трескаво за пропуска, намира го и си тръгва предпазливо.
Трето действие – крепостта Сант’Анджело.
Едва-едва се долавя ранната зора над Вечния град – звучат звънци на овце, носи се утринният камбанен звън от околните църкви. В далечината пее овчарче. Тъмничарят очаква осъдения и взвода за разстрел. Група войници довеждат Каварадоси при него и той му съобщава, че има само един час да живее. Художникът пита дали може да напише няколко думи на любимата си.
Сбогуването на Каварадоси с любимата му Тоска съдържа спомени за звездни нощи, когато те са споделяли блаженството на любовта: E lucevan le stelle (Звездите блестяха). Каварадоси размишлява, изправен пред смъртта: E non ho amato mai tanto la vita (Никога не съм обичал така живота!), а последните му думи са: Muoro disperato (Умирам в отчаяние).
Тоска се втурва въодушевена към Каварадоси и му показва пропуска, обяснявайки триумфално как е убила Скарпия. Той нежно хвали ръцете й, които са променили тяхната съдба. Тоска му обяснява, че трябва да разиграе фалшива екзекуция. Когато стрелят, трябва да падне и да се престори на мъртъв. След като войниците се оттеглят, двамата ще избягат.
Каварадоси е извикан за разстрел. Тоска покрива ушите си, когато офицерът сваля сабята си – сигнал за залп. Каварадоси пада, Тоска е горда, че нейният любим е изиграл ролята си добре, и възкликва: Ecco un artiste (Какъв артист!). Тоска призовава Каварадоси да стане и осъзнава ужасната истина – „Мъртъв! Мъртъв!” Скарпия е нарушил обещанието си, Каварадоси е убит.
Чуват се гласовете на полицаи. Сполета се втурва да хване Тоска, която го отблъсква силно. Втурва се към парапета, но преди да скочи и да намери смъртта си, извиква: O Scarpia, avanti a Dio (О, Скарпия, ще се срещнем пред Бога). Финалната музика избухва в страстно величие, гръмотевично връщане към кулминационния рефрен от сбогуването на Каварадоси: E non ho amato mai tanto la vita (Никога не съм обичал така живота!).
