Първа картина
Преддверие на гробницата на испанските крале в двореца Ескориал. Дон Карлос се е усамотил тук, покрусен от жестоката си съдба. Френската принцеса Елизабет Валоа, въпреки любовта си към Карлос, е дала съгласие в името на мира между Франция и Испания да стане съпруга на Филип II и Кралица на Испания. Споменът от първата му среща с Елизабет го кара да страда още по-силно. Идва Маркиз Поза — най-добрият му приятел. Родриго — Маркиз Поза съчувства на Дон Карлос. Неговият съвет е - най-добре ще бъде, ако Карлос веднага напусне Испания, далеч от Елизабет по-лесно ще забрави всичко. Най-добре е инфантът да замине за Фландрия и започне борба за освобождението на народа, така той ще изпълни дълга си. Дон Карлос с готовност се съгласява и двамата се заклеват да посветят живота си на борбата за свобода.
Втора картина
Живописен кът в двореца. Докато чакат краля и кралицата, принцеса Еболи, придворните дами и пажове са подхванали песен. Кралица Елизабет идва, посрещната почтително от всички. Придворната дама Еболи вижда, че Елизабет страда и се опитва да разбере причината. Родриго — маркиз Поза иска от кралицата аудиенция. Той й дава едно писмо и я моли да приеме Дон Карлос преди заминаването му за Фландрия. Изпълнена с подозрения, принцеса Еболи се мъчи да чуе разговора им. Елизабет се съгласява да приеме инфанта и заповядва всички да напуснат. При влизането на Дон Карлос чувствата на двамата избухват с нова сила. Пламенно и страстно звучат любовните им признания. Елизабет обаче се овладява бързо — тя е кралица и дългът й повелява да се откаже от любовта си. Отчаян, Дон Карлос си отива. Влиза Филип. Разгневен, че намира кралицата сама, заповядва придворната дама графиня Аремберг да бъде изпратена незабавно във Франция. Кралицата се прощава със своята приятелка и се оттегля със свитата си. Всички си тръгват, но Кралят спира маркиз Поза. В разговора си с него, Поза смело разкрива тежкото положение на народа и моли за помощ. Филип го нарича мечтател и му заявява, че е решил да очисти света от еретиците. Родриго дръзко отговаря. Смелостта на Поза прави силно впечатление на Краля и вместо да го накаже, той неочаквано разкрива пред него съмненията си, като го моли да бди зорко за поведението на кралицата и по-специално за отношенията й с Дон Карлос. Той предупреждава Родриго да се пази от Великия инквизитор и си тръгва.
Трета картина
Градина в кралския дворец. Нощ. Дон Карлос с трепет очаква насрочената му с бележка тайна среща. Идва дама със забулено лице. Това е принцеса Еболи, която също е влюбена в принца. Карлос я мисли за Елизабет и пламенно й разкрива препълненото си от любов сърце. С рязко движение дамата сваля своя воал. Еболи е узнала съкровената му тайна и заплашва да му отмъсти и разкрие всичко на Краля. Неочаквано пристига Родриго. Той веднага разбира какво се е случило и заплашва Еболи, че ще я сполети нещастие, ако издаде приятеля му. Изпълнена с ненавист, принцесата си отива. Родриго настоява Карлос да му предаде за съхранение всички тайни документи и писмата, които е получил от кралицата.
Четвърта картина
Голям площад пред катедралата. Тук ще бъдат изгорени осъдените на смърт еретици, бунтовници и реформатори. Придворните са заели местата си, народът се е събрал за да приветства своя Крал, като очаква и скорошното зрелище.Идва Великия инквизитор, а след него и крал Филип със свитата си. Внезапно пред Краля застават няколко фламандски депутати, водени от Дон Карлос. Те искат от Филип да помилва осъдените. Кралят изгонва делегацията. Тогава Карлос изважда шпагата си, той е готов да воюва за свободата на осъдените. Кралят заповядва да го обезоръжат, но никой не смее да се доближи до престолонаследника. Маркиз Поза, виждайки опасността заплашваща приятеля му, го принуждава да даде своята шпага, като лично предава оръжието, коленичейки пред Филип II. Дон Карлос е поразен от постъпката на Родриго, когото е смятал за свой най-добър приятел. Кралят провъзгласява Поза за херцог. Тържеството продължава, пламъците от кладата буйно се извисяват. Глас от небето обещава покой за осъдените, народът слави своя крал.
Пета картина
Кабинет на крал Филип. Принцеса Еболи е изпълнила заканата си, откраднала е от кралицата кутията с писмата на Карлос и я е предала на Филип. Кралят не е на себе си. Той искрено обича Елизабет и не може да се примири с нейната изневяра. Унесен е в тъжни мисли за своя живот, без любов, изпълнен с грижи и тревоги. Идва Великият инквизитор. Филип го пита как да постъпи с непокорния си син. Жестокият инквизитор предлага да бъде наказан със смърт, като еретик, заедно с маркиз Поза. Филип обаче вярва в Поза и отказва да последва съвета. Тогава Инквизиторът заплашва краля с вечно проклятие и разгневен напуска кабинета. Останал сам, Филип с горчивина признава пред себе си, че е принуден винаги да скланя глава пред Църквата. Влиза Елизабет и се оплаква, че са й откраднали ковчежето с бижута и ценни за нея неща. Кралят й показва кутията и заповядва да я отвори. Елизабет отказва. Филип сам отваря кутията, където е и портрета на Карлос и с обидни упреци се нахвърля върху нея. Елизабет загубва съзнание. Влизат Еболи и Поза. Еболи горчиво съжалява за станалото и когато кралицата идва на себе си, й признава, че тя, отблъсната от Карлос е издала тайната й на Краля. Елизабет я оставя сама да избере наказанието си – изгнание или манастир. Разкаяна, Еболи се заклева да спаси Дон Карлос.
Шеста картина
В затвора. Дон Карлос не може да забрави предателството на своя приятел. Неочаквано вратата се отваря и в затвора влиза маркиз Поза за да се прости с него. Отначало Дон Карлос не желае да го изслуша, но скоро разбира - Родриго е обречен, защото е поел цялата вина и е заявил, че сам той е водач на въстаналите фламандци. Отеква гърмеж. Родриго е смъртоносно ранен — кралят е наредил да бъде изпълнена присъдата. Преди да умре, Поза моли Дон Карлос да доведе докрай започнатото дело, както и успява да каже на приятеля си, че Елизабет ще го чака. Идва Филип, за да освободи сина си. В затвора нахлува разбунтувалият се народ, но Великият инквизитор успява да накара всички да се преклонят пред краля. Сред тълпата е и принцеса Еболи, която успява незабелязано да отведе Дон Карлос.
Седма картина
Кралица Елизабет очаква Дон Карлос, който ще дойде да се прости завинаги с нея. Инфантът заминава за Фландрия, за да изпълни завета на Родриго. Двамата се сбогуват с надеждата в сърцата си да се срещнат в „един по-добър свят", но са заварени от крал Филип и Великият инквизитор. Когато отново вижда сина си при Елизабет, обхванат oт страшен гняв, той го предава на инквизицията. След кратка неравностойна схватка, стражите пробождат Дон Карлос.
